共聚焦顯微鏡是生物學、生命科學等領(lǐng)域中觀察細胞尺度的結(jié)構(gòu)的重要儀器。通過與樣品面共軛的針孔對離焦雜散光的限制，共聚焦顯微鏡可以實現(xiàn)接近由衍射成像系統(tǒng)孔徑導致的阿貝衍射極限分辨率的成像。

　　共聚焦顯微成像是一般生物細胞學研究的常用工具，一般共聚焦成像系統(tǒng)的分辨率在半波長左右。然而目前的共聚焦顯微鏡在分辨率上仍不足以支持對細胞器、蛋白質(zhì)等更小尺度的樣品的觀察。因此，研究人員在共聚焦顯微系統(tǒng)的分辨率提升問題上投入了大量的研究，基于共聚焦顯微系統(tǒng)的超分辨顯微方法也應運而生。

　　熒光輻射差分超分辨顯微方法(FED)是一種利用正負共聚焦顯微圖像的差分后期處理來提升成像分辨率以及降低背景噪聲的方法，由浙江大學劉旭教授、匡翠方教授團隊于2013年提出。其本質(zhì)是可以在相同波長的激發(fā)光下利用空心焦斑的暗斑區(qū)域來提取實心焦斑里的高頻信息，在不需要特殊熒光標記的樣品上也可以實現(xiàn)超分辨顯微成像，具有普適性好、背景噪聲低等特點。但是該方法需要獲取兩幅共聚焦圖像來得到一張超分辨顯微圖像，這大大降低成像速度，不利于在快速運動的活細胞中進行成像研究。

　　創(chuàng)新研究

　　為了能夠更進一步提升FED的成像速度，浙江大學劉旭教授、匡翠方教授團隊進一步提出了一種共路相位調(diào)制的并行焦斑掃描方法，將FED的成像速度提升為原來的兩倍，更加適合活細胞顯微成像。

　　共路調(diào)制并行掃描方法利用偏振相關(guān)空間光調(diào)制器(SLM)分別對激發(fā)光中的S偏振光和P偏振光分別進行相位調(diào)制，其中渦旋相位調(diào)制負責形成空心暗斑，而閃耀光柵調(diào)制負責把激發(fā)光中實心亮斑和空心暗斑錯開一定距離，以此實現(xiàn)樣品面上雙焦斑聚焦結(jié)果，進一步實現(xiàn)雙焦斑并行掃描以提升FED的成像速度(圖1)。

　　圖1 共路并行熒光輻射差分超分辨顯微系統(tǒng)

　　由于該方法是在樣品表面將實心焦斑和空心焦斑錯開一定距離而實現(xiàn)并行掃描并行采集，因此采集的圖像會有一定的錯位，需要對該錯位距離進行標定，然后通過平移與裁切實現(xiàn)圖像對齊，再通過FED方法實現(xiàn)分辨率的提升，如圖2所示。

　　圖2 共路并行FED處理過程

　　為了進一步驗證該系統(tǒng)的分辨率，團隊利用100 nm熒光顆粒進行分辨率標定測試。如圖3所示，實驗結(jié)果表明，該系統(tǒng)的分辨率能夠達到133 nm，并且圖像的背景噪聲得到了進一步的降低。

　　圖3 100 nm熒光顆粒分辨率測試

　　同時，為了檢驗該系統(tǒng)在生物細胞中的應用效果，團隊采集了細胞波形蛋白的成像結(jié)果(圖4)。通過對比a1與b1、a2與b2.可以看出在較為復雜的生物細胞中，共路并行FED方法能夠在實現(xiàn)背景噪聲降低的同時提升信噪比與分辨率，具有較為優(yōu)秀的顯微成像性能。

　　圖4 細胞波形蛋白成像結(jié)果

　　總結(jié)與展望

　　通過SLM來實現(xiàn)共路并行焦斑掃描的方式既可以優(yōu)化光斑質(zhì)量保證成像效果，也可以進一步提升FED的成像速度，是一種較為實用的成像方法。

　　接下來，團隊將進一步利用全息相位調(diào)制的方法實現(xiàn)四焦斑或者六焦斑掃描以實現(xiàn)更高的成像速度提升。

　　參考文獻： 中國光學期刊網(wǎng)

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